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shRNA慢病毒细胞株构建

来源: 未知 作者:未知 点击数:326 时间:2017-09-11
  

siRNA和shRNA载体
在目前的研究中,实验基因表达水平的敲低主要是通过转染siRNA或者shRNA载体来实现的。
siRNA(Small interfering RNA)是一种21-25核苷酸的小分子RNA,由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。由于有些类型细胞脂质体效果差,转移到细胞内的siRNA半衰期短,体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制。
shRNA载体可以将siRNA把位点克隆到载体上,然后转移到细胞内转录形成siRNA,其对基因表达抑制的效果也不逊色于体外合成siRNA,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

shRNA慢病毒包装
百翼生物实验室提供带PURO筛选标记和GFP/PURO双筛选标记的shRNA载体,将目标靶点克隆到shRNA载体,然后通过转染获得慢病毒毒液。

shRNA慢病毒感染及稳转株筛选
使用慢病毒毒液感染目标细胞,然后通过筛选标记进行筛选,挑取单克隆恢复培养成细胞系(贴壁细胞),最终获得稳转细胞系。

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